Эта статья была опубликована в журнале Nature Communications 8 ноября 2023 года. В основном в ней говорится об использовании одноклеточной пространственной омики для изучения клеточной гетерогенности во время развития эндосперма кукурузы [1].

Изображение содержит Форма Описание создано автоматически

Ссылка на статью：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43006-7

Исследовательская группа — профессор У Юнжуй из Шанхайского института биологии растений.

текст Описание создано автоматически

краткое содержание

Ядро кукурузы представляет собой сложную биологическую систему, состоящую из материнской ткани, зародыша и эндосперма. Отсутствие профилей экспрессии генов с пространственной информацией ограничивает понимание конкретных функций каждой популяции клеток и затрудняет исследование элитных генов в зерне. В нашем исследовании мы провели микросрезы и пространственный транскриптомный анализ зерен кукурузы на стадии налива зерна. Это позволило авторам визуализировать закономерности экспрессии всех генов с помощью гибридизации in silico РНК in situ и идентифицировать 11 клеточных популяций и 332 гена молекулярных маркеров. Кроме того, авторы систематически выяснили механизм пространственного хранения трех основных веществ (крахмал, белок и масло) в зернах кукурузы. Эти результаты дают ценную информацию о функциональных генах, контролирующих агрономические характеристики зерна кукурузы.

История исследования

Урожай кукурузы имеет важную экономическую и пищевую ценность. Процесс развития зерен кукурузы можно разделить на следующие этапы: этап двойного оплодотворения, деления и дифференцировки клеток (1–10 DAP), этап накопления запасного материала (10–35 DAP) и этап зрелости (35–56 DAP). Эндосперм играет важную роль в развитии зерна кукурузы. На ранних стадиях развития оплодотворенная яйцеклетка подвергается быстрому делению и дифференцировке клеток, но существенного накопления запасного материала еще не произошло. Через 10 дней судьба клеток в основном определяется прекращением дифференцировки клеток, и в зернах начинают накапливаться запасные вещества, такие как крахмальные гранулы, белки и масла. Эндосперм становится основным органом накопления крахмала и белка, а зародыш служит хранилищем масла.

Понимание функции клеточных популяций, регулирующих накопление запасенных веществ, требует понимания того, как гены взаимодействуют с пространственной средой. Чтобы проанализировать эту взаимную исследовательскую ситуацию,В настоящее время пути передачи сигнала анализируются с помощью технологии повторного секвенирования. Однако информации о пространственном взаимодействии все еще относительно мало.,Микродиссекция — метод исследования пространственных структур. В этой технологии используется технология лазерной резки.,Разделение различных участков ткани в семенах кукурузы,и выполнить анализ секвенирования РНК,изучить различия в экспрессии генов в этих регионах. Это исследование идентифицирует регуляторные модули, связанные с дифференцировкой клеток эндосперма.,и идентифицировали факторы транскрипции, связанные с дифференцировкой клеток эндосперма. Результаты настоящего исследования имеют большое значение для понимания молекулярных механизмов эмбрионального развития кукурузы.

Технология пространственного транскриптома, используемая в этом исследовании, представляет собой высокопроизводительный метод анализа экспрессии генов, который может одновременно определять уровни экспрессии десятков тысяч генов в тканях и сравнивать информацию об экспрессии этих генов с их пространственным положением в тканях. Эта технология может выявить пространственное распределение и закономерности экспрессии генов в тканях путем разрезания, фиксации, секвенирования и анализа тканей, тем самым помогая исследователям понять взаимосвязь между типами клеток и тканевыми структурами, а также роль генов в развитии и процессах заболеваний. Функция.

Поэтому данная статья посвящена изучению клеточной гетерогенности во время развития эндосперма кукурузы. В исследовании использовалась технология пространственной транскриптомики для секвенирования и картирования транскриптомов различных тканей кукурузы, выявляющих пространственное распределение и закономерности экспрессии генов в клетках во время развития эндосперма кукурузы. В ходе исследования были обнаружены характерные гены различных типов клеток в эндосперме кукурузы и создана сеть совместной экспрессии генов. Кроме того, в ходе исследования был разработан онлайн-инструмент для визуального отображения моделей пространственной экспрессии генов, что облегчает аннотацию и анализ генов.

результат

Kernel size and cell expansion during maize endosperm development

Автор выбрал инбредную линию кукурузы W64A для исследования пространственной транскриптомики, поскольку она широко используется для изучения функций генов, связанных с наполняемостью зерна кукурузы и текстурой эндосперма. Для изучения всего цикла развития эндосперма автор провел 10-24 исследования. Зерна кукурузы DAP исследовали на полутонких срезах и обнаружили, что можно в основном определить наружную семенницу, слой оболочки эндосперма (эндосперм-AL), эндосперм, базальный переносной слой эндосперма (эндосперм-BETL) и другие части, а зерна кукурузы в вышеуказанный период были проанализированы срезами пространственного транскриптома.

Spatial transcriptomes reveal kernel heterogeneity and functional compartments at filling stages

Автору 12, 18, и 24 Из зерен кукурузы DAP отбирали образцы, заливали, фиксировали и разрезали для окрашивания при 10-кратном увеличении. Genomics Создание библиотеки пространственной транскриптомики и анализ данных на Visium,Было идентифицировано 25 клеточных субпопуляций (результат, обнаруженный в исследовании, имел хорошую воспроизводимость с предыдущими данными микродиссекции).,Указывает на точность результата).

Изображение содержит Иллюстрация Описание создано автоматически

Благодаря проверке данных микродиссекции, маркерных генов и экспериментов по гибридизации in situ 25 подгрупп были наконец аннотированы на 11 аннотированных вручную подгрупп.

Иллюстрация Описание создано автоматически

Преимущество пространственного транскриптома заключается в том, что он может моделировать технологию гибридизации РНК in situ для проведения гибридизации in situ нескольких генов кукурузы для определения мест их экспрессии. Авторы также обнаружили множество специфических высокоэкспрессируемых генов, экспрессирующихся в разных тканях. Чтобы изучить статус этих генов,Для построения сети WGCNA автор выбрал 2986 генов с высокой экспрессией и высокой вариабельностью.,Каждый модуль, полученный в результате анализа, соответствует 11 подгруппам, полученным путем ручного аннотирования результатов подгрупп.,Также имеется хороший контент для проверки результатов аннотаций GO. Это содержимое модуля также соответствует трем временным периодам общего развития.,Процесс от внесения удобрений до налива зерна,Эти субпопуляции клеток эндосперма имеют тесную ветвящуюся связь с процессом развития других материнских тканей.,В то же время существует сильная корреляция,Указывает на то, что, хотя ткани матери и потомства различаются по генетическому происхождению,Но их программы экспрессии генов работают вместе.

Mining key genes essential for sucrose transport and storage accumulation

Путем идентификации специфических высокоэкспрессируемых генов в вышеуказанных 11 подгруппах было получено 2992 дифференциальных гена и проведен анализ обогащения GO этих генов. Было обнаружено, что эндосперм-SE, эндосперм-VE и эндосперм-SCU соответственно демонстрируют синтез углеводов. процесс, активность пула питательных веществ и процесс метаболизма жирных кислот.

Некоторые из дифференциальных генов существуют в сети WGCNA.,На этих генах было проведено наблюдение in situ пространственного транскриптома и экспериментальная проверка гибридизации РНК in situ.,Было обнаружено, что эти гены высоко экспрессируются в эндосперме.

Среди них авторы обнаружили, что для развития эндосперма решающее значение имеют множественные факторы транскрипции, такие как семейства bHLH, MYB и GRAS.

Spatially differential distribution of storage metabolite synthesis-related transcripts in maize seeds

Стекловидный эндосперм — это особый участок семени кукурузы. Это одна из нескольких областей эндосперма, выявленных в ходе пространственных транскриптомных исследований. Стекловидный эндосперм, характеризующийся полупрозрачным внешним видом, служит для хранения питательных веществ, необходимых развивающемуся эмбриону. По мере созревания семени конденсация этих компонентов приводит к образованию стекловидного эндосперма во внешней области и мягкого крахмалистого эндосперма во внутренней области.

Авторы обнаружили, что некоторые гены, кодирующие синтазу крахмала, могут быть использованы в качестве генов-маркеров СЭ эндосперма.

Большинство генов, связанных с синтезом масла и липидов, экспрессируются в эмбриональной области. Вышеупомянутые высокоэкспрессированные гены соответствуют пространственно-специфическому накоплению масла и липидов в семенах кукурузы.

Functional validation of sucrose transporter genes

Принято считать, что при наливе зерна сахароза транспортируется из тканей-источников в ткани-поглотители. После разгрузки в области флоэмы сахароза либо расщепляется до фруктозы и глюкозы инвертазами клеточной стенки, а затем захватывается переносчиками моносахаридов, либо напрямую транспортируется в каналы зерна транспортерами сахарозы (SUT) для доставки питательных веществ. Существует много предыдущих сообщений о SUT в транспорте. Однако из-за недостаточного понимания его пространственной экспрессии и локализации точная роль SUT в процессе транспорта внеклеточной жидкой фазы неясна.

Авторы обнаружили в геноме кукурузы семь белков, связанных с транспортом сахарозы.,qRT-PCR показала, что эти семь белков экспрессируются в зернах кукурузы на разных стадиях развития.,Отображение данных авторского пространственного транскриптома,Только ZmSUT1иZmSUT7 специфически экспрессируется в BETL.,Это говорит о том, что эти два гена консервативны в пространственной регуляции.,Однако ZmSUT2, ZmSUT4 и ZmSUT5 не имеют специфической пространственной структуры в семенах кукурузы.

Иллюстрация Низкая достоверность Описание создано автоматически

Проверить работу ZmSUT1 и ZmSUT7 в процессе насыпки зерна.,Авторы специфически ингибировали экспрессию ZmSUT1 и ZmSUT7 посредством РНК-интерференции (RNAi).,Используйте промотор BETL-специфического гена (Betl9).,И были получены две независимые трансгенные линии РНКи. Автор нашел,Прорастание клеточной стенки (CWI) в области BETL семян zmsut1/7 RNAi было значительно ингибировано.,Показано, что ZmSUT1иZmSUT7 имеет решающее значение для формирования CWI.

Изображение содержит Графический интерфейс пользователя Описание создано автоматически

Чтобы исключить возможное влияние zmsut1/7RNAi на рост растений.,что влияет на развитие семян и наливность зерна.,Авторы использовали пыльцу zmsut1/7RNAi для опыления колосьев дикого типа.,Также было обнаружено, что размер и вес полученных семян-потомков значительно уменьшились.,Подтверждено, что ZmSUT1 и ZmSUT7 необходимы для обогащения зерна кукурузы. поэтому,Мутации гена ZmSUT1/7, происходящие в регионе BETL, влияют не только на фенотип этого конкретного региона.,Это также может привести к общим фенотипическим проблемам в зернах.,Главным образом из-за вмешательства в транспорт питательных веществ.

Подвести итог

Авторы описывают использование методов пространственной транскриптомики для изучения клеточной гетерогенности и функциональных доменов во время развития эндосперма кукурузы. Они прошли 12, 18 и 24. DAPобразцы для пространственного секвенирования транскриптома,Выявлено 25 пространственных кластеров,и далее объединили их в 11 клеточных популяций. Эти клеточные популяции включают две области материнского происхождения (яйцеклетка и экзосперм), две эмбриональные области (оболочка эндосперма и меристема эндосперма) и семь областей эндосперма (базальный транспортный слой эндосперма, протоковая зона, эндосперм, прилегающий к оболочке эндосперма, крахмалистый эндосперм, стекловидный эндосперм). , наружное яичко и область вокруг эмбриона). Исследователи также подтвердили эти новые типы клеток, проверив наличие маркерных генов.,и включает анатомическую информацию,дополнительно выявили функции этих клеточных популяций. Они также разработали веб-сайт,Обеспечивает прямую визуализацию карт гибридизации РНК in situ всего генома in silico.,Продвигать аннотацию генов и высококачественный анализ генов.

Можно обнаружить, что большее количество генов было определено с помощью пространственной транскриптомики. Давайте подробно представим, что такое пространственная транскриптомика.

Традиционный транскриптом может четко анализировать информацию только об фрагменте ткани. Раньше я часто анализировал транскриптом одной клетки, готовя суспензию всей ткани, а затем маркируя отдельные клетки. В это время пространственная информация терялась. , а Пространственная омика фиксирует образец и может идентифицировать различные группы клеток в образце. Местоположение ткани, в то время как пространственная транскриптомика отдельных клеток обеспечивает измерение трехмерного сигнала, фиксирует все ткани и маркирует отдельные клетки для клеток в каждом месте, обеспечивая лучший метод для последующего уменьшения размерности субпопуляции. Определяется тип клеток, дополнительная информация. анализируется, и уровень разрешения становится более точным.

Он также имеет множество применений на растениях. Например, метод стерео-секвенирования, разработанный BGI в 2022 году.,Крепление листьев арабидопсиса,Успешно выделили небольшие, но значимые различия транскриптома между верхними и нижними эпидермальными клетками [2]. Эти исследовательские основы закладывают основу для последующего применения пространственной транскриптомики отдельных клеток на большем количестве растений.,Можно проанализировать более тонкие дифференциальные гены,Улучшить понимание содержания исследования.

Ссылки

1. Fu Y, Xiao W, Tian L, Guo L, Ma G, Ji C, Huang Y, Wang H, Wu X, Yang T, et al: Spatial transcriptomics uncover sucrose post-phloem transport during maize kernel development. Nature Communications 2023, 14.

2. Xia K, Sun HX, Li J, Li J, Zhao Y, Chen L, Qin C, Chen R, Chen Z, Liu G, et al: The single-cell stereo-seq reveals region-specific cell subtypes and transcriptome profiling in Arabidopsis leaves. Dev Cell 2022, 57:1299-1310.e1294.