#Создайте программную среду Flair и установите ее.
$ conda create -n чутье -c conda-forge -c чутье биоконды
$ conda активировать чутье
$ чутье [выровнять/исправить/...]

$ docker pull brookslab/flair:latest
$ docker run -w /usr/data -v [your_path_to_data]:/usr/data brookslab/flair:latest flair [align/correct/...]

$ flair align -g genome.fa -r <reads.fq>|<reads.fa> [options]

--reads     Raw reads in fasta or fastq format. This argument accepts multiple
            (comma/space separated) files. # Выйдите из системы, чтобы секвенировать последовательность, и примите .fasta. или Файл формата .fastq; несколько отдельных файлов могут быть разделены запятыми или пробелами.

At least one of the following arguments is required (Укажите хотя бы одного человека):
--genome    Reference genome in fasta format. Flair will minimap index this file
            unless there already is a .mmi file in the same location. # Эталонная последовательность генома (.fa), миникарта автоматически создаст индекс.
--mm_index  If there already is a .mmi index for the genome it can be supplied
            directly using this option. # Вы можете напрямую ввести индексный файл мини-карты. .mmi。

--help              Show all options. Команда #Помощь.
--output            Name base for output files (default: flair.aligned). You can supply
                    an output directory (e.g. output/flair_aligned) but it has to exist;
                    Flair will not create it. If you run the same command twice, Flair
                    will overwrite the files without warning. #выходной путь к папке с файлом и префикс файла, папка должна быть создана самостоятельно.
--threads           Number of processors to use (default 4). #Threads, по умолчанию — 4.
--junction_bed      Annotated isoforms/junctions bed file for splice site-guided
                    minimap2 genomic alignment. папка сайта #isoform/junction Комментарий, используемая для выравнивания генома мини-карты.
--nvrna             Use native-RNA specific alignment parameters for minimap2 (-u f -k 14) Параметр прямого секвенирования #РНК.
--quality           Minimum MAPQ score of read alignment to the genome. The default is 1,
                    which is the lowest possible score. #Значение MAPQ сравнения по умолчанию равно наименьшему 1.
-N                  Retain at most INT secondary alignments from minimap2 (default 0). Please
                    proceed with caution, changing this setting is only useful if you know
                    there are closely related homologs elsewhere in the genome. It will
                    likely decrease the quality of Flair's final results. #Сохраняйте лучшие результаты сравнения, значение по умолчанию — 0.
--quiet             Dont print progress statements. #Не выводить процесс.

usage: flair correct -q query.bed12 [-f annotation.gtf]|[-j introns.tab] -g genome.fa [options]

--query             Uncorrected bed12 file, e.g. output of flair align. #Файл bed12, сравниваемый на предыдущем шаге.
--genome            Reference genome in fasta format. #Справочный файл генома.

At least one of the following arguments is required:
--shortread         Bed format splice junctions from short-read sequencing. You can
                    generate these from SAM format files using the junctions_from_sam
                    program that comes with Flair. # Для вырезанных сайтов (формат папка) из секвенирования короткого чтения второго поколения можно использовать собственный сценарий Junctions_from_sam компании FLAIR для преобразования файла SAM, созданного после выравнивания, в файл BED.
--gtf               GTF annotation file. #genomeКомментарий файл.

--help              Show all options Команда #Помощь.
--output            Name base for output files (default: flair). You can supply an
                    output directory (e.g. output/flair) but it has to exist; Flair
                    will not create it. If you run the same command twice, Flair will
                    overwrite the files without warning.  #выходной путь к папке с файлом и префикс файла, папка должна быть создана самостоятельно.
--threads           Number of processors to use (default 4). #Threads, по умолчанию — 4.
--nvrna             Specify this flag to make the strand of a read consistent with
                    the input annotation during correction. Параметр прямого секвенирования #РНК.
--ss_window         Window size for correcting splice sites (default 15). #Исправьте размер окна (диапазона) места обрезки, значение по умолчанию — 15.
--print_check       Print err.txt with step checking. #Вывод сообщения об ошибке.

usage: flair collapse -g genome.fa -q <query.bed> -r <reads.fq>/<reads.fa> [options]

--query     Bed file of aligned/corrected reads #Завершенная/исправленная последовательность
--genome    FastA of reference genome #referencegenome
--reads     FastA/FastQ files of raw reads, can specify multiple files #Оригинальные данные секвенирования третьего поколения fasta/fastq,Можетобозначениемногоиндивидуальный。

--help              Show all options. #помощь
--output            Name base for output files (default: flair.collapse). #имявыходной файл, по умолчанию — flair.collapse.
                    You can supply an output directory (e.g. output/flair_collapse) #обозначениевыходной файл-клип.
--threads           Number of processors to use (default: 4). #Количество потоков, по умолчанию — 4.
--gtf               GTF annotation file, used for renaming FLAIR isoforms to
                    annotated isoforms and adjusting TSS/TESs. Файл #gtfКомментарий, переименование изоформы, используемой для кластеризации FLAIR, настройка начального и конечного сайтов транскрипта.
--generate_map      Specify this argument to generate a txt file of read-isoform
                    assignments (default: not указано).#Сгенерировать текстовый файл, соответствующий последовательности изоформы, которая не указана по умолчанию.
--annotation_reliant        Specify transcript fasta that corresponds to transcripts
                    in the gtf to run annotation-reliant flair collapse; to ask flair
                    to make transcript sequences given the gtf and genome fa, use
                    --annotation_reliant generate. #Создайте соответствующий файл последовательности транскрипта fasta.

--support           Minimum number of supporting reads for an isoform; if s < 1,
                    it will be treated as a percentage of expression of the gene
                    (default: 3). #Минимальная последовательность поддерживает одну индивидуальную изоформу, значение по умолчанию — 3.
--stringent         Specify if all supporting reads need to be full-length (80%
                    coverage and spanning 25 bp of the first and last exons). #Поддерживаемые последовательности должны быть полноразмерными (охват 80%, первый индивидуальный и последний индивидуальный экзон должны содержать не менее 25 индивидуальных оснований)
--check_splice      Enforce coverage of 4 out of 6 bp around each splice site and
                    no insertions greater than 3 bp at the splice site. Please note:
                    If you want to use --annotation_reliant as well, set it to
                    generate instead of providing an input transcripts fasta file,
                    otherwise flair may fail to match the transcript IDs.
                    Alternatively you can create a correctly formatted transcript
                    fasta file using gtf_to_psl # Охватите как минимум 4 отдельных сайта в разрезе 6индивидуальных, и вставленная последовательность не может составлять примерно 3 п.н.
--trust_ends        Specify if reads are generated from a long read method with
                    minimal fragmentation. #Если последовательность получена методом построения библиотеки длинных последовательностей (минимальное прерывание)
--quality           Minimum MAPQ of read assignment to an isoform (default: 1). #Последовательность классифицируется как наименьшее значение MAPQ изоформы.

--longshot_bam      BAM file from Longshot containing haplotype information for each read. Файл #BAM, содержащий информацию о гаплотипе.
--longshot_vcf      VCF file from Longshot. Файл #VCF, содержащий информацию о мутациях.

--end_window        Window size for comparing transcripts starts (TSS) and ends
                    (TES) (default: 100). #Размер окна сравнения начала и конца расшифровок, по умолчанию 100.
--promoters         Promoter regions bed file to identify full-length reads. Папка #промоторной области для идентификации полноразмерной последовательности.
--3prime_regions    TES regions bed file to identify full-length reads. Папка #области терминации транскрипта для идентификации полноразмерной последовательности.
--no_redundant      <none,longest,best_only> (default: none). For each unique
                    splice junction chain, report options include:
                            - none          best TSSs/TESs chosen for each unique
                                            set of splice junctions #Выберите лучшее начало и конец для каждого отдельного участка вырезания.
                            - longest       single TSS/TES chosen to maximize length #Выберите самый длинный.
                            - best_only     single most supported TSS/TES #одининдивидуальный поддерживает больше всего.
--isoformtss        When specified, TSS/TES for each isoform will be determined
                    from supporting reads for individual isoforms (default: not
                    specified, determined at the gene level). #Начало и конец транскрипции каждой изоформы определяется последовательностью, которая ее поддерживает.
--no_gtf_end_adjustment     Do not use TSS/TES from the input gtf to adjust
                    isoform TSSs/TESs. Instead, each isoform will be determined
                    from supporting reads. #Не используйте файл Комментарий для исправления начала и конца изоформы.
--max_ends          Maximum number of TSS/TES picked per isoform (default: 2). #Максимальное значение TSS/TES, выбранное для каждой индивидуальной изоформы, значение по умолчанию — 2.
--filter            Report options include:
                            - nosubset      any isoforms that are a proper set of
                                            another isoform are removed #В то же время удаляются изоформы, отнесенные к другим категориям.
                            - default       subset isoforms are removed based on support #Удалить подмножество изоформ на основе поддерживаемых значений.
                            - comprehensive default set + all subset isoforms
                            - ginormous     comprehensive set + single exon subset
                                            isoforms

--temp_dir          Directory for temporary files. use "./" to indicate current
                    directory (default: python tempfile directory). #Укажите временную папку.
--keep_intermediate         Specify if intermediate and temporary files are to
                    be kept for debugging. Intermediate files include:
                    promoter-supported reads file, read assignments to
                    firstpass isoforms. #Сохраняйте промежуточные файлы.
--fusion_dist       Minimium distance between separate read alignments on the
                    same chromosome to be considered a fusion, otherwise no reads
                    will be assumed to be fusions. #Расстояние разделения слитых генов на одной хромосоме.
--mm2_args          Additional minimap2 arguments when aligning reads first-pass
                    transcripts; separate args by commas, e.g. --mm2_args=-I8g,--MD.
--quiet             Suppress progress statements from being printed. #Процесс не выводит результаты.
--annotated_bed     BED file of annotated isoforms, required by --annotation_reliant.
                    If this file is not provided, flair collapse will generate the
                    bedfile from the gtf. Eventually this argument will be removed. #Предоставьте BED-файлы изоформ Комментарий.
--range             Interval for which to collapse isoforms, formatted
                    chromosome:coord1-coord2 or tab-delimited; if a range is specified,
                    then the --reads argument must be a BAM file and --query must be
                    a sorted, bgzip-ed bed file. #isoformsОбъединить интервалы.

$ flair collapse -g genome.fa --gtf gene_annotations.gtf -q reads.flair_all_corrected.bed -r reads.fastq
--stringent --check_splice --generate_map --annotation_reliant generate

$ flair collapse -g genome.fa --gtf gene_annotations.gtf -q reads.flair_all_corrected.bed -r reads.fastq
--stringent --no_gtf_end_adjustment --check_splice --generate_map --trust_ends

usage: flair quantify -r reads_manifest.tsv -i isoforms.fa [options]

--isoforms          Fasta of Flair collapsed isoforms #Наконец-то объединенный файл последовательности изоформ, от чутья collapse。
--reads_manifest    Tab delimited file containing sample id, condition, batch,
                    reads.fq, where reads.fq is the path to the sample fastq file. #табуляция разделенаизобразецid,Группировка экспериментальных условий,Опытная партия,Путь к данным секвенирования (reads.fq).

sample1      condition1      batch1  mydata/sample1.fq
sample2      condition1      batch1  mydata/sample2.fq
sample3      condition1      batch1  mydata/sample3.fq
sample4      condition2      batch1  mydata/sample4.fq
sample5      condition2      batch1  mydata/sample5.fq
sample6      condition2      batch1  mydata/sample6.fq

-help               Show all options #помощь Заказ
--output            Name base for output files (default: flair.quantify). You
                    can supply an output directory (e.g. output/flair_quantify).  #обозначениевыходной префикс файла и путь.
--threads           Number of processors to use (default 4). #Threads, по умолчанию — 4.
--temp_dir          Directory to put temporary files. use ./ to indicate current
                    directory (default: python tempfile directory). #Путь временного хранения файлов.
--sample_id_only    Only use sample id in output header instead of a concatenation
                    of id, condition, and batch. #В заголовке матрицы выражений отображается только имя образца, а не идентификатор, группа и партия.
--quality           Minimum MAPQ of read assignment to an isoform (default 1). #Minimum MAPQ, когда последовательности секвенирования присваиваются (классифицируются) изоформе, значение по умолчанию равно 1.
--trust_ends        Specify if reads are generated from a long read method with
                    minimal fragmentation. #Если последовательность получена методом построения библиотеки длинных последовательностей (минимальное прерывание)。
--generate_map      Create read-to-isoform assignment files for each sample. #Сгенерируйте текстовый файл, соответствующий последовательности изоформ, которая не указана по умолчанию.
--isoform_bed       isoform .bed file, must be specified if --stringent or
                    --check-splice is specified. папка #isoform. Это необходимо указать, если указан --stringentи--check-splice.
--stringent         Supporting reads must cover 80% of their isoform and extend
                    at least 25 nt into the first and last exons. If those exons
                    are themselves shorter than 25 nt, the requirement becomes
                    'must start within 4 nt from the start' or 'end within 4 nt
                    from the end'. #Поддерживаемые последовательности должны быть полноразмерными (охват 80%, первый индивидуальный и последний индивидуальный экзон должны содержать не менее 25 индивидуальных оснований)。
--check_splice      Enforces coverage of 4 out of 6 bp around each splice site
                    and no insertions greater than 3 bp at the splice site. # Охватите как минимум 4 отдельных сайта в разрезе 6индивидуальных, и вставленная последовательность не может составлять примерно 3 п.н.

usage: flair_diffExp -q counts_matrix.tsv --out_dir out_dir [options]

--counts_matrix     Tab-delimited isoform count matrix from flair quantify #flairМатрица количественного выражения.
--out_dir           Output directory for tables and plots. #выходной путь к папке с файлом.

--help              Show this help message and exit #помощь。
--threads           Number of threads for parallel DRIMSeq. #Количество потоков для запуска DRIMseq.
--exp_thresh        Read count expression threshold. Isoforms in which both
                    conditions contain fewer than E reads are filtered out (Default E=10) #isoform выражает порог подсчета. Если он ниже этого значения, он будет отброшен. Значение по умолчанию — 10.
--out_dir_force     Specify this argument to force overwriting of files in
                    an existing output directory #Выходной путь.

usage: flair_diffSplice -i isoforms.bed -q counts_matrix.tsv [options]

--isoforms          Isoforms in bed format from Flair collapse. #isoformизfolder。
--counts_matrix     Tab-delimited isoform count matrix from Flair quantify. #isoformexpression матрица
--out_dir           Output directory for tables and plots. #выходной путь к папке с файлом.

--help              Show all options. #помощь Параметры
--threads           Number of processors to use (default 4). #Использовать потоки, по умолчанию — 4》
--test              Run DRIMSeq statistical testing. #Используйте DRIMSeq для статистического анализа.
--drim1             The minimum number of samples that have coverage over an
                    AS event inclusion/exclusion for DRIMSeq testing; events
                    with too few samples are filtered out and not tested (6). #Минимальное количество выборок с охватом событий отсечения переменных (сохраняемых и исключенных).
--drim2             The minimum number of samples expressing the inclusion of
                    an AS event; events with too few samples are filtered out
                    and not tested (3). #Содержит минимальное количество выборок для сохранения событий отсечения переменных.
--drim3             The minimum number of reads covering an AS event
                    inclusion/exclusion for DRIMSeq testing, events with too
                    few samples are filtered out and not tested (15). #Минимальное количество операций чтения, охватывающих события отсечения переменных (сохраняемые и исключаемые).
--drim4             The minimum number of reads covering an AS event inclusion
                    for DRIMSeq testing, events with too few samples are
                    filtered out and not tested (5).#Содержит минимальное количество операций чтения для сохранения событий обрезки переменных.
--batch             If specified with --test, DRIMSeq will perform batch correction. #DRIMSeq может выполнять пакетную калибровку.
--conditionA        Specify one condition corresponding to samples in the
                    counts_matrix to be compared against condition2; by default,
                    the first two unique conditions are used. This implies --test. #Укажите группу сравнения для дифференциального анализа.
--conditionB        Specify another condition corresponding to samples in the
                    counts_matrix to be compared against conditionA. #Укажите группу сравнения для дифференциального анализа.
--out_dir_force     Specify this argument to force overwriting of files in an
                    existing output directory #Выходной путь.

a3ss_feature_id     coordinate                  sample1 sample2 ... isoform_ids
inclusion_chr1:80   chr1:80-400_chr1:80-450     75.0    35.0    ... a,e
exclusion_chr1:80   chr1:80-400_chr1:80-450     3.0     13.0    ... c
inclusion_chr1:500  chr1:500-650_chr1:500-700   4.0     18.0    ... d
exclusion_chr1:500  chr1:500-650_chr1:500-700   70.0    17.0    ... e

a3ss_feature_id     coordinate                  sample1 sample2 ... isoform_ids
inclusion_chr1:80   chr1:80-400_chr1:80-450     75.0    35.0    ... a,e
exclusion_chr1:80   chr1:80-400_chr1:80-450     3.0     13.0    ... c
inclusion_chr1:500  chr1:500-650_chr1:500-700   4.0     18.0    ... d
exclusion_chr1:500  chr1:500-650_chr1:500-700   70.0    17.0    ... e

a3ss_feature_id     coordinate                  sample1 sample2 ... isoform_ids
inclusion_chr1:80   chr1:80-400_chr1:80-450     75.0    35.0    ... a,e
exclusion_chr1:80   chr1:80-400_chr1:80-450     3.0     13.0    ... c
inclusion_chr1:500  chr1:500-650_chr1:500-700   4.0     18.0    ... d
exclusion_chr1:500  chr1:500-650_chr1:500-700   70.0    17.0    ... e