1. Процесс создания геномной библиотеки PacBio SMRTbell

1. Структура библиотеки PacBio SMRTbell

Библиотека секвенирования, созданная платформой секвенирования PacBio, имеет форму гантели. Вот почему это называется SMRT bell,  Как показано в правой части рисунка 1. Его основными компонентами являются: разъем в форме шпильки (Шпилька Адаптер) и матрица двухцепочечной ДНК (Double Stranded DNA Шаблон). После того, как текст построен,、Перед секвенированиемЕще нужно завершитьSMRT библиотека колоколов, секвенирование Primer、DNA Работа смешивания полимеразы (отжиг праймера секвенирования связывается с кольцевым адаптером секвенирования, а затем комплекс библиотеки праймер-колокольчик связывается с ДНК-полимеразой).  Рисунок 1 справа и рисунок 2 показаны.

Рисунок 1. Структура и процесс создания геномной библиотеки SMRTbell.

Рисунок 2. Праймеры для секвенирования библиотеки SMRTbell и ДНК-полимераза.

2. Процесс создания геномной библиотеки SMRTbell.

В качестве примера возьмем геномную библиотеку HiFi (библиотека 10–20 КБ), как показано слева на рисунке 1:

1) После получения геномной ДНК (г ДНК) путем экстракции нуклеиновых кислот сначала используйте пробирку G-трубку или систему Megaruptor для фрагментации генома до подходящего размера (обычно 20 КБ для геномов животных и растений для создания библиотеки и 10 КБ для геномов животных и растений). для микробных геномов для создания библиотеки);

2) Получите полную вставку двухцепочечной ДНК, выполнив такие действия, как удаление одноцепочечных выступов, восстановление повреждений и восстановление концов;

3) Создайте библиотеку секвенирования SMRTbell, подключив адаптеры SMRTbell к обоим концам двухцепочечной ДНК для получения кольцевой матрицы.

4) После завершения лигирования адаптера продукт лигирования необходимо очистить и применить ферментную обработку для расщепления линейных или внутренне поврежденных кольцевых молекул ДНК (бесплатный адаптер-шпилька, шаблоны ДНК с адаптерами, не соединенными с обоими концами, кольцевая ДНК с внутренними повреждениями). ) Шаблон), после завершения ферментативной обработки обычно используется система Bulepippin или Sage ELF для разрезания геля и восстановления библиотеки в пределах целевого диапазона размеров.

два、PacBio Subreads and HiFi reads

HiFi reads（High Fidelity reads) — это консенсусная последовательность на основе Circular, запущенная PacBio в 2019 году. Consensus Режим секвенирования, CCS) создает систему, учитывающую большую длину считывания (~10-20 kb）Высокая точность（>99%Точность）данные последовательности секвенирования (Рисунок 3).

Рисунок 3. Чтение HiFi — долгое и точное

Для фрагмента ДНК, подлежащего секвенированию, в режиме секвенирования CCS длина считывания фермента (полимеразная read) намного больше длины вставленного фрагмента,Полимераза будет выполнять секвенирование по катящемуся кругу вокруг матрицы ДНК.,Вставленный целевой фрагмент будет секвенирован несколько раз.。Создано за один цикл секвенированияслучайныйОшибки последовательности,Серия избыточныхSubreadsчтобы исправить себя。проходитьPacBioРазработано компаниейалгоритм CCSПосле самостоятельной коррекции,Наконец, очень точныйCCS read, Поскольку качество секвенирования каждой базы выше, оно называется HiFi. read (Рисунок 4).

Рисунок 4. Концепция считывания HiFi и процесс создания

3. PacBio передает данные в HiFi, считывает данные.

Pacbio Sequel II Платформа поддерживает CLR (непрерывный Long Читает）иCCS（Циркуляр Consensus Секвенирование) два метода секвенирования. CLRРежим для библиотек очень длинных фрагментов（> 25 kb), данные субчтений, полученные вне машины, не будут обрабатываться дальше и могут использоваться непосредственно в качестве исходных данных для последующего анализа. Единственным недостатком является то, что точность каждого чтения ниже.

Начиная со второй половины 2022 года, последний комплект сборки библиотеки SMRTbell prep kit 3.0 отказывается от режима CLR и полностью принимает режим построения и секвенирования библиотеки CCS. Таким образом, субчтения, исходящие от машины, должны проходить через алгоритм CCS для устранения избыточности. и конвертировать подчтения в чтения HiFi. Пользователям платформы Pacbio Sequel II данные дополнительного чтения вне машины необходимо преобразовать в данные чтения HiFi с помощью программы CCS в программном обеспечении SMRTlink на сервере или запустив отдельно установленное программное обеспечение CCS. Для платформ Pacbio Sequel IIe и Revio, поскольку сам инструмент секвенирования имеет встроенный вычислительный сервер, его можно настроить через SMRTlink перед запуском секвенирования, а данные считывания HiFi можно получить непосредственно после отключения машины.

Поэтому, когда вы получаете данные секвенирования PacBio, например, при загрузке общедоступных данных, особенно ранних данных, вы должны уточнить, является ли это дополнительным чтением или чтением HiFi. Данные, недавно полученные от поставщиков услуг секвенирования, обычно считываются HiFi после запуска программного обеспечения CCS.

Пользователи, у которых есть инструменты PacBio и их серверы настроены с помощью программного обеспечения SMRTlink, могут запустить программу CCS (циклического консенсусного секвенирования) непосредственно в SMRTlink. После завершения операции вы также получите отчет анализа CCS в SMRTlink, который предоставит информацию. HiFi читает информационно-статистическую информацию, отображение наглядных графиков.

Следующее руководство подготовлено нашими студентами и преподавателями, у которых нет инструмента секвенирования или установки и настройки программного обеспечения SMRTlink, но которые хотят установить и запустить программу CCS на своих собственных серверах или высокопроизводительных рабочих станциях.

4. Установка и использование программы CCS

Официальный сайт СКС:https://ccs.how/

Официальный сайт CCS (github):https://github.com/PacificBiosciences/ccs

1. Убедитесь, что миниконда установлена.

#Используйте conda напрямую, чтобы установить последнюю версию pbccs
$ conda install -c bioconda pbccs

#Версия 6.4.0

2. Работа программного обеспечения

Pacbio Sequel Данные о высадке II платформы представлены в формате bam. Файлы bam можно напрямую адаптировать к большинству последующих программ анализа. Файлы, в которых хранятся достоверные данные, обычно называются: *.subreads.bam, *.subreads.bam.pbi。

входной файл：sample.subreads.bam и соответствующий индексsample.subreads.bam.pbi

выходной файл：unaligned BAM (.bam);bgzipped FASTQ (.fastq.gz)。

Базовое использование, все параметры по умолчанию:

#генерировать .bam документ
$ ccs  sample.subreads.bam  sample.ccs.bam

#генерировать .fastq.gz документ
$ ccs  sample.subreads.bam  sample.hifi.fastq.gz

Расширенное использование

#генерировать.bamдокумент
$ ccs  --min-rq  0.99 --min-passes 3 -j 12  sample.subreads.bam  sample.ccs.bam

#генерировать .fastq.gz документ
$ ccs  --min-rq  0.999 --min-passes 5  -j 24  sample.subreads.bam  sample.hifi.fastq.gz

#Следующие параметры часто устанавливаются и могут быть настроены в соответствии с потребностями данных и приложения. Остальные параметры могут быть установлены по умолчанию.
-j  12    Количество потоков ЦП
--min-passes 3     Минимальный создаваемый CCS read Количество дополнительных чтений, по умолчанию — 3.
--min-rq  0.99       Базовая точность, по умолчанию — 0,99, равная Q20.
--min-length         Минимальная длина чтения, по умолчанию — 10.
--max-length        Максимальная длина чтения, по умолчанию — 50000.

CCS --help документ и параметры, при необходимости вы можете изменить их самостоятельно:

ccs - Generate circular consensus sequences (ccs) from subreads.

Usage:
  ccs [options] <IN.subreads.bam|xml> <OUT.ccs.bam|fastq.gz|xml>

  IN.subreads.bam|xml       FILE   Subreads (.subreads.bam or .subreadset.xml).
  OUT.ccs.bam|fastq.gz|xml  FILE   Consensus reads (.bam, .fastq.gz, or .consensusreadset.xml).


Input Filter Options:
  --min-passes              INT    Minimum number of full-length subreads required to generate CCS for a ZMW. [3]
  --min-snr                 FLOAT  Minimum SNR of subreads to use for generating CCS [2.5]
  --top-passes              INT    Pick at maximum the top N passes for each ZMW. [60]

Draft Filter Options:
  --min-length              INT    Minimum draft length before polishing. [10]
  --max-length              INT    Maximum draft length before polishing. [50000]

Chunking Options:
  --chunk                   STR    Operate on a single chunk. Format i/N, where i in [1,N]. Examples: 3/24 or 9/9
  --max-chunks                     Determine maximum number of chunks.

Model Override Options:
  --model-path              STR    Path to a chemistry model file or directory containing model files.
  --model-spec              STR    Name of chemistry or model to use, overriding default selection.

Processing Options:
  --by-strand                      Generate a consensus for each strand.
  --hd-finder                      Enable heteroduplex finder and splitting
  --skip-polish                    Only output the initial draft template (faster, less accurate).
  --all                            Emit all ZMWs.
  --subread-fallback               Emit a representative subread, instead of the draft consensus, if polishing failed.
  --all-kinetics                   Calculate mean pulse widths (PW) and interpulse durations (IPD) for every ZMW.
  --hifi-kinetics                  Calculate mean pulse widths (PW) and interpulse durations (IPD) for every HiFi read.

Output Filter Options:
  --min-rq                  FLOAT  Minimum predicted accuracy in [0, 1]. [0.99]

Output Files Options:
  --report-file             FILE   Where to write the results report.
  --report-json             FILE   Where to write the results report as json.
  --metrics-json            FILE   Where to write the zmw metrics as json.
  --suppress-reports               Do not generate report or metric files per default, only those requested.

  -h,--help                        Show this help and exit.
  --version                        Show application version and exit.
  -j,--num-threads          INT    Number of threads to use, 0 means autodetection. [0]
  --log-level               STR    Set log level. Valid choices: (TRACE, DEBUG, INFO, WARN, FATAL). [WARN]
  --log-file                FILE   Log to a file, instead of stderr.

Copyright (C) 2004-2022     Pacific Biosciences of California, Inc.
This program comes with ABSOLUTELY NO WARRANTY; it is intended for
Research Use Only and not for use in diagnostic procedures.

5. Объяснение словаря на английском языке, связанного с режимом секвенирования CCS.

Что касается полимеразы, прочитайте, подчитайте оригинальное английское объяснение CCS.

Объяснение словаря на английском языке, связанного с режимом секвенирования CCS