Предварительное резюме

В прошлый раз я вкратце это для вас организовал.Понимание кривых идентификации клеток,вИспользуйте nCount_RNA или nFeature_RNA, чтобы нарисовать кривую идентификации клеток на языке R и найти подходящее пороговое значение.,Был проведен предварительный контроль качества.

Также упоминается в конце,Редко в дальнейшем будут исходные необработанные данные.,Обычно мы используемcellrangerПосле контроля качестваданныепровести анализ。Однако для обработанныхданныенабор, мы можемВизуализируйте nFeature_RNA и nCount_RNA, чтобы помочь в контроле качества.

Тогда сначала мына основеУчебники с официального сайта SeuratРазберемся и рассмотримnFeature_RNA и nCount_RNA,И предварительный просмотр определяет порог,Затем узнайте о применении в реальных ситуациях анализа.。

Введение в nFeature_RNA и nCount_RNA

После создания объекта seurat,когда ничего не делаешь,seurat создаст метаданные для каждой ячейки и сохранит их в файле метаданные.

#readданныеcreate seuratobject
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "./filtered_gene_bc_matrices/hg19/")

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, 
                           project = "pbmc3k", 
                           min.cells = 3)
                           
> dim(pbmc)
[1] 13714  2700

Содержание каждого столбца:

• orig.ident：Обычно содержит известное название образца,По умолчанию используется значение, которое мы присвоили проекту.,Если значение не присвоено, это SeuratProject.
• nCount_RNA：каждой ячейкиUMIчисло
• nFeature_RNA：обнаруживается в каждой ячейкеиз Генчисло

можно увидетьnCount_RNAиnFeature_RNAЕсть еще различия,Это связано с ихМетод расчетасвязанный

#nCount_RNA: общее количество UMI — это количество транскриптов.
colSums(sce@assays$RNA$counts)

#nFeature_RNA: общее количество генов
colSums(sce@assays$RNA$counts>0)

Визуализация и пороговое суждение

Вы можете использовать графики скрипки, чтобы просто визуализировать nFeature_RNA и nCount_RNA.

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA"))

Перед фильтрацией

диаграмма nFeature_RNA：Отражает количество генов, экспрессируемых каждой клеткой образца.,Сверхэкспрессия может указывать на двуклеточность или многоклеточность.,Если экспрессия слишком низкая, капли могут быть пустыми или содержать РНК из окружающей среды.

график nCount_RNA：отражает содержимое, содержащееся в каждой ячейкеUMIКоличество – это количество транскриптов.

В процессе анализа данных секвенирования 10X Genomics после дегенерации результатов секвенирования через UMI вы можете увидеть, сколько генов было прочитано в клетке. Обычно клетка может получить 40 000–80 000 эффективных UMI. В среднем один ген в клетке имеет около 10 UMI.

Итак, мы делаемпороговое суждениекогда,может быть непосредственно основано наЗначение nFeature_RNA — это количество генов.

пороговое суждение

We filter cells that have unique feature counts over 2,500 or less than 200

Официальный сайт дает значения больше 200 и меньше 2500, но после визуализации мы видим, что верхний предел равен 2000, что на самом деле нормально.

Однако pbmc — это относительно ранние данные. Количество измеренных ячеек относительно невелико, и верхний предел установлен относительно низко. Если это текущие данные по одной ячейке, все равно требуется специальный анализ данных.

#Фильтрация по пороговому значению и предварительному просмотру
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2000)

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA"))

> dim(pbmc)
[1] 13714  2692

После фильтрации

После фильтрации,Количество ячеек изменилось с исходных 2700 на текущие 2692, а некоторые ячейки были отфильтрованы.

ВышеупомянутоеЧасть контента QC в pbmc3k_tutorial на официальном сайте seurat Далее посмотрим на его применение на реальных данных.

Применение в практическом анализе

Если у вас есть стандартный код анализа для анализа отдельных ячеек в дереве навыков, при необходимости вы можете получить ссылку: https://pan.baidu.com/s/1bIBG9RciAzDhkTKKA7hEfQ?pwd=y4eh

Это в нашемscRNA_scriptsСуществуетqc.Rконтроль качества Скриптдокумент,Он предназначен для контроля качества считываемых данных.

Скрипт Функция сначала вычисляетсяВизуализируется соотношение митохондрий, рибосом и эритроцитов (подробности будут в следующем выпуске), а затем визуализируется состояние этих параметров в клетках.Давайте сначала сосредоточимся на этомnFeature_RNA и nCount_RNA

#qc.RСкриптсерединаnFeature_RNA и Часть nCount_RNA

feats <- c("nFeature_RNA", "nCount_RNA")
p1=VlnPlot(input_sce, group.by = "orig.ident", features = feats, pt.size = 0, ncol = 2) + 
    NoLegend()
p1 
w=length(unique(input_sce$orig.ident))/3+5;w
ggsave(filename="Vlnplot1.pdf",plot=p1,width = w,height = 5)

Перед контролем качества

Как правило, при выполнении стандартного процесса при создании объекта seurat он будет основан на min.cells. = 5 и мин.функции = 300 для фильтрации, поэтому этот этап фильтрации не выполняется в qcСкрипт. Но просто взглянем на Перед фильтрациейизмениться после,мы можемВыполните простую операцию фильтрации на основе результатов визуализации.。

#Простая фильтрация
 if(T){
    selected_c <- WhichCells(input_sce, expression = nFeature_RNA > 500 & nFeature_RNA < 2500)
    selected_f <- rownames(input_sce)[Matrix::rowSums(input_sce@assays$RNA$counts > 0 ) > 3]
    input_sce.filt <- subset(input_sce, features = selected_f, cells = selected_c)
    dim(input_sce) 
    dim(input_sce.filt) 
  }
  
  #Визуализация После фильтрациииз Состояние  feats <- c("nFeature_RNA", "nCount_RNA")
  p1_filtered=VlnPlot(input_sce.filt, group.by = "orig.ident", features = feats, pt.size = 0, ncol = 2) + 
    NoLegend()
  w=length(unique(input_sce.filt$orig.ident))/3+5;w 
  ggsave(filename="Vlnplot1_filtered.pdf",plot=p1_filtered,width = w,height = 5)
  

После фильтрации

Основное значение контроля качества: в каждом образце можно удалить некоторые гены со слишком высоким или слишком низким уровнем экспрессии.

Помимо визуализации nFeature_RNA и nCount_RNA в клетках во время основного процесса контроля качества, мы также будем визуализировать nFeature_RNA и nCount_RNA при выполнении кластеризации с уменьшением размерности.

Применение в кластеризации уменьшения размерности ячеек

При выборе соответствующего порогового значения для предварительного просмотра,мы будем использоватьcheck-all-markers.RСкрипт,Визуализируйте на основе общих генов-маркеров и рисуйте диаграммы umap.

существоватьcheck-all-markers.RСкрипт,Помогите нам проверить и подтвердить экспрессию генов в каждой субпопуляции клеток, тем самым помогая нам определить, является ли это двойной клеткой.。

Конкретные твиты:Как исключить двойные клетки

Когда мы просто называем подгруппы,Обычно выбирают более низкое разрешение 0,1.,ЧтосуществоватьGSE208706данныеиз0.1Группировкасередина,Мы ясно видим, что Группа 9 относительно длинная и узкая.,и содержит маркерные гены для двух разных субпопуляций клеток.。

Чтобы определить, является ли это двойной ячейкой,Нам нужно объединитьОценивали общее количество РНК отдельных клеток в каждой субпопуляции.

if("percent_mito" %in% colnames(sce.all.int@meta.data ) ){

  #Визуализация Указанное выше соотношение ячеек
  feats <- c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent_mito", "percent_ribo", "percent_hb")
  
  feats <- c("nFeature_RNA", "nCount_RNA")
  p1=VlnPlot(sce.all.int , features = feats, pt.size = 0, ncol = 2) + 
    NoLegend()
  w=length(unique(sce.all.int$orig.ident))/3+5;w
  ggsave(filename=paste0(pro,"Vlnplot1.pdf"),plot=p1,width = w,height = 5)
  
  feats <- c("percent_mito", "percent_ribo", "percent_hb")
  p2=VlnPlot(sce.all.int,  features = feats, pt.size = 0, ncol = 3, same.y.lims=T) + 
    scale_y_continuous(breaks=seq(0, 100, 5)) +
    NoLegend()
  w=length(unique(sce.all.int$orig.ident))/2+5;w
  ggsave(filename=paste0(pro,"Vlnplot2.pdf"),plot=p2,width = w,height = 5)
  
}

Результат визуализации nFeature_RNA показал, что уровень экспрессии группы 8 был высоким, тогда как экспрессия группы 9 была нормальной.。на основеMarkerГенный вывод №.8Группа находится на стадии распространения.изклетка,Таким образом, высокий уровень экспрессии является разумным.

и после увеличения разрешения,ОбнаружитьГруппа 9 подразделяется на две подгруппы и не является двуклеточной.。

Обычно мыОн будет оцениваться на основе срединной линии и максимального значения, а затем разрешение будет увеличено, чтобы увидеть, разделены ли субпопуляции, а затем является ли это двойной ячейкой.

Соотношение митохондрий

На официальном сайте и в рамках нашего стандартного процесса контроля качества.,Можно рассчитатьСоотношение митохондрий

насизqc.RСкриптсередина Это верноСоотношение рибосом и эритроцитовБыли произведены расчетыи Визуализация,Давайте вместе узнаем об этом содержании в следующем выпуске!