Сегодня четвертый день Лунного Нового года, и это Новый год. Я провел в больнице всю ночь. Когда я проснулся, исследовательская группа в Пекине задала мне вопрос при анализе экзома и космических данных об отдельных клетках. где клиническое применение одноклеточного пространства? Фактически, основываясь на моем опыте работы, я думаю, что клиническое применение одиночных клеток еще далеко, но применение космоса начало обретать форму. Давайте кратко рассмотрим.

Мы все знаем, что существуют три основные системы в области специального тестирования, а именно система обнаружения генов опухолей (WES), система генетического обнаружения и система генетического обнаружения инфекционных заболеваний (mNGS и tNGS). Система обнаружения является наиболее распространенной, за ней следует система генетического обнаружения. Короче говоря, tNGS в настоящее время внедрен меньше. Итак, если мы хорошо понимаем пространство одиночных клеток и клинические испытания, легко увидеть связь между VDJ и метагеномным тестированием.

Отдельные клетки также можно использовать для метагеномики и VDJ, но для отдельных клеток используется метод drop-seq, и после обработки часть ткани теряет большую часть своей информации. Для каждого образца для последующего анализа остается только около 10 000 клеток. много недостатков на прикладном уровне, и предстоит пройти долгий путь до клинического применения.

Но пространство другое. В статье представлено обнаружение пространственного метагенома.

Процесс обнаружения микроорганизмов человека-хозяина GATK PathSeq и его применение на холостом ходу

Пространственная метагеномика одноклеточных клеток раскрывает роль микробиоты в пространственной и клеточной гетерогенности рака

Пространственная метагеномика одноклеточных клеток раскрывает роль микробиоты в пространственной и клеточной гетерогенности рака2

Более того, метод пространственного транскриптомного обнаружения патогенных микроорганизмов стал зрелым, поэтому патогенные микроорганизмы, обнаруженные на прикладном уровне, и их специфическое расположение в частях тканей окажут большую помощь для приложений в области медицины.

Другой связующей точкой является VDJ. Одноклеточный VDJ существует уже много лет, но он не может решить нашу реальную проблему. Самая фундаментальная причина заключается в том, что до сих пор невозможно найти целевую последовательность VDJ, которая действительно нацелена на конкретные опухоли.

В клинических применениях, таких как популярная в настоящее время терапия CAT-T, лечение CAR-T-клетками сначала требует сбора периферической крови пациента и сортировки Т-клеток. Т-клетки стимулируются и амплифицируются in vitro и проходят через вирус. переносится в специфический ген CAR, называемый CAR-T, а затем амплифицированный CAR-T вводится обратно пациенту, чтобы оказать запрограммированное противоопухолевое действие в организме пациента.

Базовая структура CAR показана на рисунке ниже.

Молекулы CAR включают три основные части: внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Антигенсвязывающий домен во внеклеточном домене обычно представляет собой одноцепочечный фрагмент молекулы scFv, полученный из антитела, который в основном состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела и средней линкерной области. , а затем соединяется через шарнирную область (Hinge). Прикрепляется к трансмембранному домену, отвечающему за распознавание антигена. Основная функция трансмембранного домена — закрепление молекулы CAR на клеточной мембране, что играет важную роль в стабильности экспрессии молекулы CAR. Внутриклеточный домен включает костимулирующий домен и домен сигнальной трансдукции, которые вместе отвечают за полную активацию Т-клеток. Среди них, путем добавления костимулирующего домена к области передачи внутриклеточного сигнала CD3ζ CAR первого поколения, постепенно были получены CAR второго, третьего и даже четвертого поколения. В настоящее время CAR второго поколения все еще используется. более клинически.

Т-клеточный антигенный рецептор (TCR) экспрессируется на поверхности Т-клеток. TCR является характерным маркером на поверхности всех Т-клеток. Он связывается с CD3 посредством нековалентных связей, образуя комплекс TCR-CD3. заключается в распознавании антигенов. Для активации Т-клеток необходимы два сигнала. Первый сигнал — это сигнал TCR, образованный комбинацией вышеупомянутых молекул TCR и пептид-MHC, но этого сигнала недостаточно для активации Т-клеток в состоянии покоя. Только при наличии второго костимулирующего сигнала, обеспечиваемого CD28 и его рецептором, могут синтезироваться РНК и белки, связанные с активацией Т-клеток, секретироваться ключевой цитокин IL-2, и клетки переходят из фазы G0 в период G1. . Следовательно, именно костимулирующие сигналы и сигналы TCR вместе завершают активацию Т-клеток.

Фактически, увидев это, мы в основном поняли, что суть заключается в распознавании антигенов. Один из докторов наук из Гарварда связался со мной и спросил, могу ли я найти специфически нацеленные TCR/BCR, анализируя VDJ одиночных опухолевых клеток. . Везде, где их можно найти, остальную часть иммунотерапии. С некоторыми из них он вполне справляется, и уже через несколько лет сможет произвести высокоэффективную иммунотерапию опухолевой ткани. Могу ли я придумать план? Честно говоря, я очень взволнован, но в сочетании с многолетним опытом одиночной терапии. клеточный анализ, этот путь неосуществим. Слишком легко идти, но пространство - ВДЖ. Исследование кажется более ценным.

Я также много писал о космических VDJ, список которых приведен ниже.

Первый в мире пространственный транскриптомный анализ FFPE выявил противоопухолевый механизм третичных лимфоидных структур при почечно-клеточном раке

10-кратное увеличение инновационной технологии пространственной транскриптомы: одновременное измерение РНК и TCR (BCR)

10-кратный анализ пространственного транскриптомного иммунного репертуара

Science｜Spatial VDJ позволяет проводить исследования пространственной транскриптомики В- и Т-клеток.

Среди них пространственный VDJ является наиболее важной проблемой, которую необходимо решить. С одной стороны, речь идет не только о поиске последовательностей TCR или BCR, которые могут проникать в опухолевую ткань, но также и о выявлении гетерогенности внутри опухолевой ткани и уникальных для нее последовательностей VDJ. каждая гетерогенная область. Это на самом деле дает хорошую возможность полностью победить опухоли.

Или, если пойти еще дальше, получение информации о мутациях и информации о VDJ в различных областях гетерогенности опухоли одновременно будет значительно способствовать применению последующей иммунотерапии.

Здесь мы взглянем на последнюю научную статью,Spatial transcriptomics of B cell and T cell receptors reveals lymphocyte clonal dynamics

Пространственная транскриптомика рецепторов В-клеток и Т-клеток выявляет клональную динамику лимфоцитов. Журнал:Наука Импакт-фактор: 56,9 Опубликовано: декабрь 2023 г.

Пространственное распределение клонов лимфоцитов внутри тканей имеет решающее значение для их развития, отбора и распространения. В статье предлагается пространственная технология VDJ (Spatial VDJ), которая позволяет пространственно анализировать рецепторы В-клеток и рецепторы Т-клеток. Существует две версии этого метода: одна используется для изучения полноразмерных транскриптов иммуноглобулина (IG) и Т-клеток (TR) с использованием секвенирования длинного чтения третьего поколения (long-read, LR), а именно LR Spatial VDJ The; другой — секвенирование с коротким чтением второго поколения (short-read, SR), используемое только для изучения TR, то есть SR Spatial VDJ. Обе версии используют технологию гибридизационного захвата, нацеленную на константные области генов IG и TR.

Базовые знания

В-клетки и Т-клетки реагируют на инфекцию и воспаление.,Регулируют гомеостаз тканей,и поддерживать иммунную память。Целевая реактивность В-клеток и Т-клеток определяется их клонально наследуемыми антигенными рецепторами.。Одноклеточная технология позволяет изучать рецепторы антигенов на клеточном уровне,Но ему не хватает пространственного разрешения. Современные методы пространственной транскриптомики (ST) не способны сохранить полноразмерные транскрипты антигенных рецепторов.,Поскольку на этапе подготовки библиотеки удаляются области, определяющие комплементарность, необходимые для определения клональности лимфоцитов.3(CDR3)сегментация。Пространственный анализ клональности лимфоцитов может связать специфические антигенные рецепторы с опухолеассоциированными, собственными или чужеродными антигенами, что может помочь в идентификации и использовании антигенспецифических клонов для терапии.。Было разработано несколько методов пространственного разрешения последовательностей антигенных рецепторов в тканях человека.。К ним относятся методы, основанные на полимеразной цепной реакции.(PCR)изTклеточный рецептор(TCRs)изSTилиSlide-seqУсиление библиотеки,Лазерная микродиссекция в сочетании с секвенированием,и путем глубокого секвенирования захвата редких более длинных транскриптов иммуноглобулина (IG) остаточных последовательностей области CDR3 в библиотеках ST. Однако,В настоящее время отсутствуют методы комплексного картирования полноразмерных последовательностей B-клеточных рецепторов (BCR) и TCR и их родственных связей в тканях высокопроизводительным и удобным для пользователя способом.

В этой работе была разработана пространственная транскриптомика последовательностей вариабельности, разнообразия и соединения (VDJ). VDJ), технология, которая картирует полноразмерные транскрипты BCR и TCR в тканях человека. Пространственный VDJ — это пространственная экспрессия гена Visium (Spatial) свежезамороженной ткани. GEX)из扩展,Этот метод основан на полиаденилировании срезов тканей.RNAиз3'-Целевые штрих-коды。Пространственная библиотека GEX из ткани миндалин человека выявила повышенную экспрессию константных генов BCR и TCR。несмотря на это,Они по-прежнему представляют собой лишь небольшую часть всей библиотеки. перед фрагментацией,Последовательности области CDR3 можно получить путем пространственного штрих-кодирования полноразмерных изображений Visium. к ДНК амплифицировали с помощью ПЦР. Поэтому секвенирование областей CDR3 и пространственных штрих-кодов из Spatial GEX Библиотеки к ДНК должны стать возможным методом определения клональности и местоположения транскриптов антигенных рецепторов.

Outline of the PCR approach targeting the V and C genes of each receptor chain (TRB, IGHG, or IGHM) from full-length Spatial GEX cDNA libraries (top).

Авторы разработали две пространственные версии VDJ: (i) пространственный VDJ с длинным считыванием (LR), который генерирует библиотеки с пространственным штрих-кодом полноразмерных транскриптов рецепторов антигенов IG и Т-клеток (TR) (ii) пространственный с коротким считыванием (SR); VDJ VDJ используется только для последовательностей TR и использует двухэтапный полугнездовой метод ПЦР, основанный на соседних V-праймерах cdr3. В обоих методах зонды гибридизационного захвата, нацеленные на константные области TR и IG, использовались для обогащения транскриптов антигенных рецепторов при сохранении пространственных штрих-кодов, уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) и полноразмерных последовательностей рецепторов. Гибридный захват значительно увеличил количество UMI и пространственных штрих-кодов для TR и IG и сохранил распределение транскриптов IG и TR по сравнению с необогащенной пространственной библиотекой GEX.

Hybridization target capture of IG and TR constant regions increases the IG and TR gene counts in spatial transcriptomics libraries

Подводя итог: Spatial VDJ является расширением технологии 10-кратной пространственной экспрессии генов Visium (Spatial GEX). Spatial GEX использует последовательности 3'-поли А в срезах ткани для целевого захвата. Перед этапом фрагментации последовательность области CDR3 можно получить полностью. -пространственный штрих-код. ПЦР-амплификация выполняется в к ДНК Visium (рис. 2А). Таким образом, с помощью этой технологии можно получить последовательность штрих-кода области CDR3 и пространственную библиотеку к ДНК GEX, а также информацию об уровне экспрессии и положении транскрипта рецептора антигена. можно получить одновременно. Среди них: (i) технология пространственного VDJ с длинным чтением (LR), которая может создавать пространственную полноразмерную библиотеку транскриптомов рецепторов IG и TR; (ii) технология пространственного VDJ с коротким чтением (SR), которая может создавать только TR; библиотека последовательностей рецепторов. В обоих методах зонды гибридизационного захвата, нацеленные на константные области TR и IG, использовались для обогащения транскриптов антигенных рецепторов при сохранении пространственных штрих-кодов, уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) и полноразмерных последовательностей рецепторов. Гибридный захват значительно увеличил количество UMI и пространственных штрих-кодов для TR и IG и сохранил распределение транскриптов IG и TR по сравнению с необогащенными пространственными библиотеками GEX.

Принципиальная схема пространственной технологии VDJ и диаграмма результатов анализа

В статье эта технология применяется к некоторым случаям, например, пространственный VDJ, который нас больше всего беспокоит, захватывает клоны В- и Т-клеток в опухолях человека.

Картирование клонов B- и T-клеток в опухолях может помочь в идентификации и терапевтическом использовании индивидуальных или популяционных клонов для повышения опухолеассоциированного иммунитета.。文章从两个未经治疗изHER2положительные опухоли молочной железы(P1иP2)созданный вSpatial GEXиVDJбиблиотека。Для лучшего отражения неоднородности внутри пациента,Разделите биопсию на несколько областей,Маркированный регион от A (RegA) до региона RegE,Каждая область содержит опухоль, границу опухоли и прилегающую неопухолевую ткань.。существовать每个患者и切片середина鉴定出数千个独特изIG克隆последовательностьи数百个独特из克隆TRпоследовательность,Наибольшее количество уникальных клонов обнаружено вне области опухоли. В участках, обогащенных цитоплазматическими бластами и макрофагами, экспрессирующими апоэ.,Наибольшее количество клонотипов IG,Это предполагает наличие связи между инфильтрирующими опухоль макрофагами и плазматическими клетками.。Иметь самый высокийTR受体计数изspot富含髓细胞иT细胞相关基因и细胞亚群,Подобно зрелым третичным лимфоидным структурам (TLS) в P2.,Но не в P1. Некоторые клоны IGH являются общими для TLS-подобных и богатых плазмобластами областей.,Это предполагает, что по крайней мере некоторые опухолеассоциированные бласты могут происходить из TLS-активированных В-клеток.

Путем сопоставления секвенирования одноклеточной РНК (RNAseq) одной и той же опухоли. VDJ (scVDJ) анализ,Подтверждение примерно половины пространственных цепей TR-рецепторов, определенных VDJ.,Аналогично схеме амплификации TRB на основе пространственной ПЦР.。Для клона IG,Подтверждено LRSpatial только через scVDJ VDJ数据集из3.0и2.9%. scVDJ обнаруживает примерно в 10 раз больше TR, чем клоны IG.,В Spatial VDJ все наоборот. Анализ показывает,Spatial VDJ (по сравнению с scVDJ) легче захватывает клоны плазматических клеток, возможно, из-за обильной экспрессии транскрипта IG в каждой плазматической клетке и чувствительности плазматических клеток к протоколам диссоциации отдельных клеток. Напротив, пространственный Снижение обнаружения клонов TR с помощью VDJ может быть связано с неэффективным захватом редких транскриптов в данных (из-за низкой экспрессии TR на клетку и/или на клон). Эти ограничения могут также применяться к редким клонам В-клеток, поскольку В-клетки экспрессируют более низкие уровни транскриптов IG по сравнению с плазматическими клетками. Поддержка пространственная VDJ в большей степени отражает концепцию расширенного клонирования с помощью Spatial. scVDJ, предоставленный VDJ Клоны TR содержали больше клеток на клон, а клоны scVDJ, обнаруживаемые в нескольких областях опухоли, чаще были пространственными. Захват ВДЖ.

扩大肿瘤浸润изB细胞иTКлоны клеток могут указывать на локальные антигенспецифические взаимодействия с потенциалом модуляции опухоли.。Опухоли содержат фенотипически разнообразные лимфоциты, но определить, какие клоны и субпопуляции В- или Т-клеток непосредственно взаимодействуют с опухолями, сложно.。существовать匹配из肿瘤活检середина,Пространственный VDJ в сочетании с scVDJ показывает, что расширенные клоны Т-клеток обогащены на границе опухоли относительно неопухолевых областей или внутри опухоли.。Эти клоны демонстрируют изменения отCD4илиCD8эффекторные клетки к регуляторнымT细胞из表型。поэтому,Spatial VDJ предоставляет платформу,Определение предполагаемых клонотипов, чувствительных к опухоли, на основе пространственного распределения и клеточного статуса,Это невозможно при анализе свободной ткани.。анализировать发现这与扩增изBКлонирование клеток особенно актуально。существоватьP2середина,发现了四个不同из肿瘤cluster。Различные клоны IG были значительно обогащены на границах отдельных опухолевых кластеров, два из которых (клон IGL 6 и клон IG 39) соответствовали переключающим B-подобным клеткам (IGHA1 и IGHG1 соответственно).。大多数克隆существовать肿瘤边界из有限部分富集,Указывает на местный антигенсвязывающий ответ (например,,Клоны IG колокализуются с различными опухолевыми субклонами, экспрессирующими разные антигены). Все опухолевые кластеры обогащены раковыми клетками,Но показали разные обогащенные гены. Эта внутриопухолевая гетерогенность может приводить к различному росту опухоли и ответам на лечение в пределах одной и той же опухоли [например,,Различные клоны IG вызывают антителозависимое уничтожение опухолевых клеток в разных местах опухоли]. поэтому,Сочетание неконтролируемых методов с пространственным VDJ может идентифицировать потенциальные опухолевые антигенные рецепторы, обогащенные определенными областями опухоли.

Парные последовательности BCR или TCR определяют связывание антигена.。Пространственный VDJ захватывает отдельные транскрипты антигенных рецепторов и поэтому не может самостоятельно определять пары рецепторов.。Однако,Парные рецепторные цепи должны совместно локализоваться в тканях.。использовать匹配из单细胞VDJ数据集来验证配对受体изиспользовать,анализировать观察到大多数IG对существовать活检区域具有很高из空间相关性。Чтобы предсказать пары антиген-рецептор исключительно на основе данных Spatial VDJ, была разработана вычислительная система под названием «восстановление».。поэтому,Использовать пространственный «Репарация» VDJ потенциально может быть использована для прогнозирования образования de novo парных рецепторов IG в тканях человека для дальнейших исследований антител.

Spatial VDJ uncovers B cell spatial evolution

Пространственный VDJ также выявил разнообразие семейств клонов В-клеток внутри и между различными фолликулами В-клеток (включая зародышевые центры), которые являются ключевыми местами для экспансии и созревания клонов В-клеток. Пространственный филогенетический анализ В-клеток показывает, что ветвление и географическое распределение клонов В-клеток синхронизированы.

Жизнь хороша, с тобой еще лучше